使用木霉菌提纯葡聚糖酶
β－D－葡聚糖是一种高效生物应答物（BRM）。其在免疫促进、抗肿瘤及预防糖尿病方面早已得到广泛认可。我国啤酒工业每年产生大约4×105吨废酵母，已有不少研究对其开展了回收蛋白质、核酸、维生素及其他可溶性营养物（用作添加剂）的实验，但对提取酵母β－葡聚糖的研究不多。这些残渣要么被廉价售作饲料，要么当垃圾处理，造成了环境污染。因此，提纯酵母β－葡聚糖的研究意义重大。
β－1,3－葡聚糖不溶于水、酸、碱以及醇和醚等，在实际使用中广受限制。Bao等使用化学修饰法提高了β－1,3－葡聚糖的溶解性。但该法过于剧烈，其生物活性也降低了，化学残留与污染也成问题。β－1,3－葡聚糖酶可温和地修饰β－1,3－葡聚糖，并保持其生物活性，使其溶于水及其他溶剂，因此，酶法降解β－1,3－葡聚糖在技术上和生物学方面都具有重大意义。同时，不同来源的β－葡聚糖酶已被证实具有不同活性。胞外葡聚糖酶已成功地从真菌如Cladorrhinumfoecundissimum，Talaromycesemersonii和Rhizopusoryzae中提取。
粗酶提取的方法为：取固态发酵培养基，加入NaAc缓冲液于室温下浸提，用沃特曼滤纸过滤残余菌丝和颗粒。滤液在高速冷冻离心机中离心，上清液即为β－1,3－葡聚糖粗酶。
粗酶纯化方法为：粗酶液中添加（NH4）2SO4，在冷冻沉降机中离心，取沉淀溶于NaAc缓冲液，装透析袋透析。使用乙二醇（PEG600）脱水浓缩沉淀，DEAE－琼脂糖凝胶CL－6B柱层析，洗脱液分别收集并脱水浓缩。
经SDS－PAGE分析，该酶分子量近似54.6KD。酶最适反应pH为5.0，最适温度为50℃。在pH3.0－5.0、温度30℃－70℃之间酶活相对稳定。Fe3+、Mg2+、Mn2+以及Cu2+对该酶有抑制作用，Zn2+、Cav和Fe2+则有激活作用。底物选择性研究表明，该酶为β－1,3、β－1,4－葡聚糖酶，可作用于含β－1,3、β－1,4糖苷键的底物，对含α－1,4和α－1,6糖苷键的底物无作用。 |
