胃酸分泌是由胃组织中壁细胞来完成的,H+-K+-ATP酶(H+-K+-ATPase),又名质子泵,在胃酸分泌过程中起着关键作用。它通过自身磷酸化和去磷酸化,将细胞外液中的K+转运入细胞内,同时逆浓度梯度将细胞内的H+泵出细胞外,完成H+/K+电中性跨膜离子转运和胃酸分泌功能。H+-K+-ATPase专一性的存在于壁细胞中,H+-K+-ATPase的活性增强,胃酸分泌能力也相应增加,反之则相反。目前人们常以胃液的pH来判断胃的泌酸功能,但由于胃液的酸度受到食糜和胃其他分泌物的影响,这个指标并不能完全反映胃自身泌酸能力的强弱。因此,H+-K+-ATPase不仅可以更精确客观地衡量胃酸分泌能力,同时也是所有胃酸分泌调控途径的最后作用靶点。在人医临床上已开发了许多抑制H+-K+-ATPase活性的药物,如奥美啦唑、兰嗦啦唑等,用来治疗胃酸分泌过多症,而对增强H+-K+-ATPase活性的药物研究相对较少。仔猪腹泻给养殖业带来了巨大损失,而胃酸分泌不足是导致仔猪腹泻的重要原因,如何有效地促进胃酸分泌是人们关注的热点。
半胱胺(cysteamine,CS)是生长抑素(somatostatin,SS)的耗竭剂,它通过破坏SS半胱氨酸残基上的二硫键,使SS生物活性和免疫活性丧失,从而解除SS对胃酸分泌的抑制作用,促进胃酸分泌。尽管已有很多关于CS的报道,但在畜牧上大多集中在CS的促生长作用上,而CS对仔猪胃酸分泌调节的研究尚未见报道。在人医临床上CS对胃酸分泌调节的研究大多以鼠为动物模型,并且以整体实验为主,而体外研究的报道较少。在整体情况下,影响胃酸分泌的神经体液因素很多并且很复杂,而体外条件下细胞不受体内复杂内环境的影响,细胞周围的环境也易于控制,因此结合体外试验能更好地研究胃酸分泌的调节。不论是体内还是体外试验,都还未见CS对H+-K+-ATPase表达和活性影响的报道。因此,本试验通过半胱胺盐酸盐(cysteaminehydrochloride,CSH,有效成分是CS)处理体外培养的仔猪胃黏膜细胞,探讨CSH对H+-K+-ATPase表达和活性的影响,并同时观察SS表达的变化,以期在细胞和分子水平深入揭示CS对仔猪胃酸分泌功能的调节及其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料和试剂
28日龄哺乳期健康仔猪购自江苏农科院实验猪场,体质量8kg左右。CSH(Sigma公司,M6055,纯度>98%)。DMEM高糖培养基(Gibco),胎牛血清(杭州四季青公司),胰蛋白酶(Amresco),细胞培养板(Costar)等。
1.2 胃黏膜细胞培养
参照Terano等方法并稍作调整。仔猪宰杀后,迅速取出胃,用4℃含5倍于正常浓度双抗生素(青霉素100U/mL和链霉素100g/L)的D-Hanks液洗去胃内容物,分离胃底和胃窦黏膜,将黏膜剪成1mm3左右的小块,用加正常浓度双抗生素的0.15%胰蛋白酶37℃消化5次,每次20min,100目网筛过滤,滤液以1000r/min离心10min,沉淀以Hanks液悬浮,再重复离心1次,最后沉淀以DMEM高糖培养液(含胎牛血清10%,青霉素100U/mL和链霉素100g/L)制成细胞悬液,用0.1%台盼蓝染色检测细胞存活率在90%以上。将细胞调整至1×106个/mL,接种到6孔培养板上,然后将细胞放入CO2培养箱中进行培养(37℃,5%CO2)。
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